ДТ-96

ДТ-96 является оптимальным выбором как для диагностических лабораторий, требующих высокой пропускной способности при выполнении рутинных анализов, так и для научных учреждений, где важна возможность оптимизации и тонкой регулировки.
Особенности ДТ-96:

• Высокая производительность благодаря 96-луночному формату приспособленному к стандартным планшетам, пробиркам и стрипам;
• Мультиплексная детекция с использованием до 5-ти каналов флуоресценции и различных комбинаций флуорофоров (в базовой комплектации ДТ-96 поставляется с 4-мя каналами настроенными на Hex, Fam, Cy5, Rox, пятый канал может быть установлен по желанию заказчика);
• Долговечность источников света, представляющих собой светодиоды (LED), отличающихся высокой продолжительностью (до 100 000 ч) и стабильностью работы в отличие от галогеновых ламп;
• Высокая чувствительность, соотношение сигнал/шум и низкий уровень помех между каналами обеспечиваются с помощью оригинального оптического тракта, включающего в себя отдельный источник света на каждый канал и ПЗС-матрицу (CCD камеру);
• Широкий динамический диапазон детекции достигается применением метода множественной экспозиции, позволяющего на качественно новом уровне оптимизировать условия регистрации сигнала, упростить (или отменить вообще) фотометрические настройки;
• Работа с различным типом флуорофоров, благодаря комплектации оптическими системами с различными спектральными характеристиками*;
• Термоблок позволяет задавать градиент температуры отжига, открывая дополнительные возможности для оптимизации программ амплификации;
• Автономное выполнение задания и восстановление программы (в результате отключения питания или остановки компьютера) благодаря встроенному микроконтроллеру и дисплею;
• Простота управления и гибкость настроек осуществляется с помощью русскоязычного программного обеспечения, ориентированного на пользователя различного уровня подготовки;
• Предусмотрена возможность работы с программой как в компактном так и в развернутом режиме, что обеспечивает комфортную среду, как для клинических, так и для исследовательских приложений;
• Возможность работы с роботизированными системами пробоподготовки благодаря специальной геометрии корпуса и выдвижному термоблоку с автоматическим приводом;
• Возможность работы в рамках интегрированных лабораторных систем благодаря сохранению данных в стандартных графических и текстовых форматах и сопряжению с базами данных;
• Повышение производительности обеспечивается тем, что несколько приборов могут управляться одним компьютером. Кроме того, обработка данных пользователем может производиться на данном компьютере во время выполнения другой программы амплификации;
• Небольшая занимаемая площадь позволяет организовать комплекс из нескольких приборов для увеличения производительности;
• Прибор является открытой системой и не привязан к конкретным реагентам и пластику. В то же время, «ДНК-технология» производит реагенты для большинства существующих на сегодняшний день приложений ПЦР в реальном времени.

Технические характеристики:

рпв

При использовании термоциклера ДТ-96 у врача-лаборанта в распоряжении имеется русскоязычная программа, которая автоматически обрабатывает полученные данные, что значительно экономит время исследования. Кроме того, программа позволяет выдавать результаты в удобной и наглядной форме:

Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании прибора «ДТ-96» (пример).
А. Создание шаблона теста
Выбрать меню Tест, затем Создать/Редактировать тест. В открывшемся окне выбрать Создать новый тест. Задать (выбрать) следующие параметры теста:

• Тип – Качественный, Метод – Пороговый (Ct);
• Объем рабочей смеси в пробирке — 30 мкл;
• Флуорофоры: FAM, HEX, ROX – Cпецифика, Cy5 – ВКО;
• Программа амплификации – AmpliSens-1 (отредактированная в соответствии с табл.):

Программа амплификации AmpliSens-1

Нажать кнопку OK для сохранения теста.

Б. Проведение амплификации и детекции с использованием шаблона теста

• В меню Протокол нажать кнопку Добавить тест, задать количество исследуемых образцов и контролей («К+» и «К-»).
• Задать схему расположения образцов в реакционном блоке, указав для каждого образца его идентификатор. Нажать кнопку Применить.
• При использовании только наборов реагентов для выявления одного микроорганизма достаточно назначить детекцию по каналам FAM – Специфика и HEX – ВКО. Можно отключить детекцию по другим каналам (ROX, Cy5), указав для них тип флуорофора — Отсутствует.
• Открыть реакционный блок с помощью кнопки Открыть блок и поставить реакционные пробирки в ячейки блока в соответствии с предварительно заданной в протоколе схемой расположения пробирок. Закрыть блок с помощью соответствующей кнопки.
• В меню Запуск программы амплификации проверить правильность выбранной программы амплификации (AmpliSens-1) и объема реакционной смеси (30 мкл), заданных в шаблоне теста. Запустить выполнение программы амплификации и детекции, нажав кнопку Запуск программы.

В. Анализ результатов, полученных при использовании прибора «ДТ-96»
Полученные данные анализируют с помощью программного обеспечения прибора «ДТ-96». Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции данного образца с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов.
При использовании комплектов реагентов для выявления ДНК одного микроорганизма анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по 2 каналам:
— по каналу FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма,
— по каналу HEX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации ДНК ВКО.

• Выбрать в выпадающем списке Тип анализа пункт Качественный.
• Выбрать Метод – Пороговый (Сt)
• Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма.

Выбрать канал FAM в списке выбора оптического канала.
Установить пороговую линию на 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» в последнем цикле амплификации. При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала.
Чтобы установить пороговую линию необходимо перетащить ее с помощью левой кнопки мыши. Чтобы выделить график образца «К+» (или другого образца), можно выделить данный образец в окне Результаты.

• Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК ВКО.

Выполнить аналогичные операции для данных по каналу HEX.

1. Выбрать канал HEX в списке Выбор оптического канала.
2. Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации.

Результаты интерпретируются следующим образом:

А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM определено значение Ct. При этом график флуоресценции данной пробы должен пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM не определено (отсутствует) значение порогового цикла Сt (график флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу HEX определено значение Ct, не превышающее граничного значения 33.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM не определено значение порогового цикла Ct и в таблице результатов по каналу HEX значение Ctтакже отсутствует или превышает 33. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.

Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл.).

Результаты для контролей различных этапов ПЦР-анализа:

Граничные значения порогового цикла по каналу FAM для положительного контроля

При использовании наборов реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»
анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по всем каналам, используемым для детекции. Для каждого из анализируемых микроорганизмов результаты амплификации фрагмента ДНК микроорганизма регистрируются по соответствующему каналу, указанному для используемого набора реагентов и в инструкции по его применению (каналы FAM, или HEX, или ROX). Результаты амплификации ДНК ВКО при использовании наборов для выявления трех микроорганизмов регистрируются по каналу Cy5, а при использовании наборов для выявления двух микроорганизмов («дуплексов») — по каналу ROX.
Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия значений пороговых циклов Ct по каждому из каналов, в соответствии с назначением каналов для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов и ДНК ВКО, согласно табл. 20 (раздел «Анализ и интерпретация результатов»).

•    Выбрать в выпадающем списке Тип анализа пункт Ct(Cp) для всех каналов.
•    Выбрать Метод – Пороговый (Сt).
•    Анализ результатов амплификации фрагментов ДНК выявляемых микроорганизмов.

Необходимо последовательно проанализировать результаты по каждому из используемых каналов следующим образом:

• Выбрать нужный канал в списке выбора оптического канала.
• Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» в последнем цикле амплификации (уровень флуоресценции считают равным ближайшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой). При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала.
• Чтобы установить пороговую линию, необходимо перетащить ее с помощью левой кнопки мыши. Чтобы выделить график образца «К+» (или другого образца), нужно выделить данный образец в окне Результаты.
• Для удобства при интерпретации результатов рекомендуется скопировать графу с полученными значениями пороговых циклов в соответствующую графу таблицы Excel.
• Анализ результатов амплификации фрагмента ДНК ВКО.
• Выбрать в списке канал, назначенный для ВКО: при использовании наборов для выявления трех микроорганизмов – канал Cy5, при использовании наборов для выявления 2 микроорганизмов («дуплексов») – канал ROX.
• Установить пороговую линию на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца «К+» (ПКО) в последнем цикле амплификации. При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца «К+» показывал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала.
• Для удобства при интерпретации результатов рекомендуется скопировать графу с полученными значениями пороговых циклов в соответствующую графу таблицы Excel.

Результаты интерпретируются следующим образом: 

А) ДНК микроорганизма обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу, назначенному для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма, определено значение Ct. При этом график флуоресценции данной пробы должен пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) ДНК микроорганизма не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для регистрации сигнала об амплификации фрагмента ДНК данного микроорганизма не определено (отсутствует) значение порогового цикла Сt (график флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу для ВКО (канал Сy5 для тестов первой группы, канал ROX для тестов второй группы) определено значение Ct, не превышающее граничного значения 36.
В) Результат анализа невалидный, если для данной пробы в таблице результатов по всем каналам для регистрации сигнала об амплификации фрагментов ДНК анализируемых микроорганизмане определено значение порогового цикла Ct, и в таблице результатов по каналу, назначенному для ДНК ВКО, значение Ctтакже отсутствует или превышает 36. В таком случае требуется повторно провести амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» или повторить исследование соответствующего клинического образца, начиная с этапа экстракции ДНК.

Для автоматизированного учета результатов можно использовать соответствующую программу («AmpliSens <сокращенное название набора> Results Matrix»), предоставляемую производителями набора. Необходимо проанализировать данные по каждому из каналов, полученные значения пороговых циклов скопировать из таблицы результатов и вставить в графу в таблице программы для автоматизированного учета результатов.

Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для «+» и «-» контролей амплификации и «-» контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контролей:

Результаты контролей различных этапов ПЦР-анализа

Граничные значения пороговых циклов для положительного контроля ПЦР

Пример результатов, полученных на приборе «ДТ-96»:
Результаты, полученные при использовании набора «АмплиСенс® C.trachomatis/Ureaplasma/ M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»
  
  

• Результат для «-» контролей «B-» и «К-» — отрицательный, для «В-» регистрируется значение Ct<36 по каналу Cy5 (канал для ВКО). Результат для «+» контроля «К+» - положительный, значения Сt по всем каналам не превышают граничных. Результаты контролей соответствуют требуемым. Результаты для исследуемых образцов считают достоверными.
• В образцах 6 и 7 не обнаружены ДНК ни одного из микроорганизмов, по каналу Сy5 определены значения Ct менее 36.
• В образце 1 обнаружена ДНК микроорганизма, для которого результаты амплификации регистрируются по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.)
• В образце 3 обнаружены ДНК микроорганизмов, для которых результаты амплификации регистрируются, соответственно, по каналу FAM (здесь – Chlamydia trachomatis) и по каналу НЕХ (здесь – Ureaplasma spp.)
• В образце 4 обнаружены ДНК микроорганизмов, для которых результаты амплификации регистрируются. cоответственно, по каналу HEX (здесь – Ureaplasma spp.) и по каналу ROX (здесь – Mycoplasma hominis).
• Для образца 5 получен невалидный результат – отсутствуют значения Ct по всем каналам